實(shí)驗(yàn)概要

從土壤微生物中提取總DNA并純化，高質(zhì)量的DNA可用于后續(xù)文庫(kù)構(gòu)建。

主要試劑

TENP緩沖液（50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0）

PBS緩沖液（137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4, pH 7.4）

DNA提取緩沖液（100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na3PO4, 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0）

蛋白酶K（25 mg/mL）

溶菌酶（50 mg/mL, pH 8. 0）

20% SDS

氯仿

異戊醇

異丙醇

70%乙醇

RNAse 20 mg/mL

QIAXⅡ大片段凝膠回收試劑盒（Qiagen）

主要設(shè)備

50mL、1.5 mL離心管

搖床

高速離心機(jī)

水浴鍋

電泳槽

電泳儀

MixMax漩渦振蕩器

實(shí)驗(yàn)材料

土壤樣品

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 總DNA提取：

    （1） 取2 g土樣，置于50mL滅菌的離心管中；

    （2） 加入10 mL TENP緩沖液（50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0）懸浮土樣，200轉(zhuǎn)搖床振蕩10min充分混勻；

    （3） 10 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)洗滌多次至上清基本為無(wú)色；

    （4） 用5 mL PBS緩沖液（137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4, pH 7.4）漂洗一次；

    （5） 沉淀加入13.5 mL DNA提取緩沖液（100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na3PO4, 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0），混勻后加入100 μL蛋白酶K（25 mg/mL）和200 μL溶菌酶（50 mg/mL, pH 8. 0），37℃水浴30 min，每隔10 min顛倒混勻；

    （6） 加入2 mL 20% SDS，65℃水浴2 h，每隔20 min顛倒混勻；

    （7） 8 000 r/min室溫離心15 min，取上清，用等體積氯仿:異戊醇（24:1）抽提一次；

    （8） 水相中加入0.6倍體積的異丙醇，4℃沉淀一夜；

    （9） 11 000 r/min 4℃離心20 min收集DNA沉淀；

    （10） 70%乙醇漂洗兩次，干燥后用100 μL ddH2O（含RNAse 20 mg/mL）溶解，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管。

2. 總DNA純化：

    （1） 配制0.8%瓊脂糖凝膠；

    （2） 每個(gè)上樣孔加入50 μL粗DNA，進(jìn)行低電壓長(zhǎng)時(shí)間電泳（4℃, 25 V, 8 h）；

    （3） 電泳結(jié)束后，切下主帶所在的凝膠（膠的體積盡可能?。?/p>

QIAXⅡ大片段凝膠回收試劑盒（Qiagen）回收：加入3倍體積的Buffer QXⅠ及適量的QIAXⅡ（Glassmilk），55℃溫浴10 min，每隔2 min輕輕用手指彈起沉淀（回收大片段時(shí)不要渦旋），待凝膠*溶解，12 000 g離心1 min，棄上清；再加入500 μL Buffer QXⅠ洗滌沉淀1次以消除剩余凝膠；再用500 μL Buffer PE洗滌沉淀2次，將沉淀晾干，加入適當(dāng)體積的ddH2O，離心后收集上清，瓊脂糖凝膠電泳確定回收效率。